TUNEL细胞凋亡检测

 tunel细胞凋亡检测 (tunel apoptosis assay)

是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的dab显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些dna内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组dna。细胞凋亡时抽提dna进行电泳检测，可以发现180-200bp的dna ladder。基因组dna断裂时，暴露的3'-oh可以在末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, tdt)的催化下加上生物素标记的biotin-dutp，随后和辣根过氧化物酶(hrp)标记的streptavidin (streptavidin-hrp)结合，Zui后在hrp的催化下通过dab显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。

技术步骤

 (1)固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋之切片进行脱蜡、水化。

(2)洗涤：玻片浸入pbs缓冲液，摇床上洗涤5min，三次。

(3)反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加反应液（每50μl反应液含tdt酶0.5μl,标记的-dutp 1μl），使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h。

(4)终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤两次，每次5min。

(5)fitc标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加fitc反应液（含fitc 2.5μg/ml），室温下避光孵育10min。

(6)洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗两次，每次5min。

(7)pi复染：将玻片置于盛有pi染液的染色缸内，室温下避光染色30min。

(8)封片：用盖玻片直接盖在含pi染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察。

4. 结果判定：用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光（波长488nm），所有的细胞核均被pi着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上fitc，显示出黄绿色荧光。

服务周期

交货时间：5-7天；

结果提供： 正常和阳性对照玻片及其1张数码照片，剩余石蜡块，检测报告；

服务说明

样品类型：悬浮生长培养细胞的甩片或涂片、贴壁生长的培养细胞、冰冻切片、常规石蜡切片

样本要求：取材保持组织新鲜（组织块以小于2cm×1.5cm×0.3cm为宜），立即放入固定液（固定液用10%福尔马林液或4%多聚甲醛缓冲液，体积为组织块的10倍以上）中，避免干燥；对于有血迹的样本，可用pbs液或生理盐水冲洗后直接放入固定液中；经固定后的样本必须在48小时内处理。

服务承诺：

1. 检测结果准确、客观、可信，但不能确保一定要得到某特定结果。

2. 在规定时间内以Zui快速将实验完成